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http://www.abahe.org:80/artigo/artigo_inteligente.php?uid=76

 

 

Ataxia Brasil Científico - TERAPIA GÊNICA NA ATAXIA DE FRIEDREICH

 

 

 


Encontro Ataxia 2008

organizado pelo

 "Colectivo Ataxias em Movimiento", Madri –

 

Madri, 29 de abril de 2008

 

Terceira mostra científica:

 

Dr. Javier Diaz Nido, Centro de Biologia Molecular Severo Ochoa. Universidade Autônoma de Madri.

 

"Terapia gênica na Ataxia de Friedreich. Modelos celulares do bulbo olfatório e sua repercussão nos afetados."

 

 

Resumo por Mari Luz Gonzáles Casas

 

Traduzido por  Danilo Define

 

 

 

A Ataxia de Friedreich é uma enfermidade produzida por deficiência da frataxina na mitocôndria. É fundamental estudar o que ocorre nas células carentes de frataxina para assim compreender melhor as bases moleculares da enfermidade, procurar biomarcadores da enfermidade para ensaiar todo tipo de estratégias terapêuticas, desde as mais clássicas - farmacológicas - até as mais recentes, como a terapia gênica. Nisso consistem os modelos celulares.

 

Foram realizados muitos estudos, porém a maior parte deles em modelos experimentais muito simples como leveduras, diferentes invertebrados ou um modelo muito acessível como as culturas de fibroblastos procedentes de pele de pacientes com AF. Todos eles foram e são muito úteis para estudar muitas funções da frataxina.

 

A deficiência da frataxina não afeta do mesmo modo todas as células. A AF não é exclusivamente uma enfermidade neurodegenerativa, posto que todas as células do organismo do paciente de AF têm deficiência de frataxina. Entretanto, somente alguns neurônios fundamentalmente e algumas outras células mostram uma alteração patológica. Portanto, a deficiência de frataxina não afeta da mesma forma todas as células. Por isso, este grupo de pesquisa concentrou-se no estudo da deficiência de frataxina nos neurônios, abordando dois aspectos:

 

a) Modelos celulares neuronais

 

b) Estratégias de terapia gênica dirigida ao sistema nervoso.

 

 

a) Modelos celulares neuronais

 

Dois tipos:

 

- Células diferenciadas de neuroblastoma humano

 

- Culturas primárias de neurônios de camundongos

 

Cada um destes modelos tem suas vantagens e suas inconveniências.

 

Linhas de neuroblastoma humano: Como modelos celulares neuronais nós estamos usando uma estratégia em forma de troco, o chamado RNA de interferência. Mediante esta técnica se diminui a expressão do gene da frataxina, e isto se faz em culturas de células. Para tanto foram usadas células diferenciadas de neuroblastoma humano. São células obtidas de tumores. Estas células se manipulam no laboratório, e nelas se induz essa deficiência de frataxina.

 

Vantagens:

 

- Oferecem uma população celular bem homogênea, diferente com o que acontece com culturas primárias. Isto está sendo muito útil para toda uma série de estudos trasnscriptônicos, bioquímicos etc., que é melhor fazer em populações celulares bem homogêneas.

 

- São células humanas.

 

Desvantagens:

 

- São células que procedem de um tumor e que se diferenciam no laboratório. Parece que são neurônios maduros, porém não podemos descartar que esta diferença não seja totalmente normal.

 

O importante de tudo isto é que se estão obtendo muitos dados: os neurônios, uma vez que alcançam a maturação se tornam mais susceptíveis a esta deficiência de frataxina; uma célula pode proliferar, diferenciar-se e somente quando alcança realmente a maturação, o déficit de frataxina induz sua degeneração. Estudou-se como se produz esta degeneração e disto se aprendeu muito.

 

Isto mesmo se fez em culturas primárias de neurônios de camundongos, diretamente extraídos do sistema nervoso central dos animais.

 

Culturas primárias de neurônios de camundongos: os neurônios são extraídos diretamente do sistema nervoso central dos camundongos. São bem relevantes, podemos isolar neurônios das zonas mais afetadas pela enfermidade, neurônios das zonas menos afetadas e estudar assim as conseqüências da deficiência da frataxina, identificar biomarcadores etc.

 

Inconvenientes:

 

- Com as culturas primárias, as populações são muito heterogêneas.

 

- São células de camundongos, não são células humanas e existem dados que nos fazem pensar que não é o mesmo o déficit de frataxina na célula de camundongo que na célula humana. Portanto, é importante dispor de modelos celulares humanos.

Devido a que nenhum destes modelos é ideal, se estão tentando desenvolver novos modelos, modelos neuronais que permitam obter neurônios humanos deficientes de frataxina. Para isso seguem-se duas vias:

 

I) Partindo-se de células-tronco embrionárias humanas, linha estabelecida na atualidade pode diferenciar os neurônios e induzir o déficit de frataxina. Assim teríamos neurônios não derivados de células tumorais nas quais poderíamos estudar a deficiência de frataxina.

 

II) Este segundo projeto consiste em obter células-tronco neuronais de biópsias de pacientes com AF. Este é um projeto que acaba de começar, em colaboração do o Dr. José Luiz Muñoz Blanco, neurologista do Hospital Universitário de La Paz (Madri). Objetivo: obter células-tronco neuronais da mucosa olfativa.

 

A mucosa olfativa é uma das poucas regiões, cujo acesso é relativamente fácil e que contém células-tronco neuronais. Na mucosa olfativa estão as células receptoras do olfato e junto a elas há uma série de células-tronco que continuamente geram novos neurônios olfatórios receptores, que vão substituindo os que vão se perdendo durante a vida. Assim podemos isolar células-tronco neuronais, cultivando-as para poder obter neurônios a partir delas e finalmente poder ter neurônios de pacientes com ataxia de Friedreich.

 

Começamos obviamente com pessoas controles "doadores voluntários", pessoas que se submetem a diferentes operações no nariz, tabique nasal etc. e que dão consentimento para extrair uma pequena biópsia. Desta biópsia se obtém células nas quais são capazes de crescer neuroesferas, já que são células-tronco neuronais. Atualmente se consegue caracterizá-las. Uma vez que se tenha um conhecimento desta técnica, o passo seguinte é obter biópsias de pacientes com AF. A partir desse momento, se utilizarão essas células, já que é um modelo celular-tronco mais apropriado para aprofundar no conhecimento e buscar aproximações terapêuticas.

 

Então, o Dr. Diaz Nido, faz um pequeno resumo da situação enquanto terapias farmacológicas. Destas terapias farmacológicas, a única que chegou a uma fase mais avançada foi a Idebenona. Demonstrou-se que protege o músculo cardíaco e também se relataram benefícios leves a nível neurológico, ainda que esta última afirmação não esteja isenta de polêmica.

 

Os modelos celulares são ferramentas muito importantes para poder provar fármacos de forma pouco dispendiosa, e experimentar em camundongos aqueles que se apresentem promissores.

 

b) Terapia gênica

 

Conceitualmente é uma terapia muito simples. Há um gene defeituoso que não produz suficiente frataxina. A idéia é colocar o gene correto para elevar a quantidade de frataxina e assim debelar a enfermidade.

 

Para colocar o gene nas células é necessário encaixá-lo a um vetor, e que esse vetor seja muito eficiente para que leve o gene ao maior número de células possíveis; só assim o organismo terá um bom funcionamento. Tem que ser vetores herpes virais, que são os que cumprem as características requeridas.

 

O primeiro requisito é ter um modelo animal de ataxia de Friedreich, um camundongo que padecesse da enfermidade. Os camundongos e os humanos têm diferenças fisiológicas significativas e foi muito difícil obter um modelo de camundongo que produzisse fielmente a AF. Alguns se parecem, porém não existem muitos modelos. Devido a que não existem bons modelos, se recorreu a um truque: obter camundongos modificados geneticamente. Ao gene da frataxina foi colocada uma espécie de marcas, de tal maneira que usando uma enzima recombinasa-Cre, se consegue eliminar de maneira específica um fragmento de ADN situado entre duas seqüências denominadas loxP. Na presença de recombinasa-Cre, qualquer seqüência de DNA que se encontre situada entre dois pontos loxP será eliminada do genoma. Assim se elimina o gene da frataxina. Desta forma se mimetiza no camundongo o que acontece na enfermidade. 

 

Com este modelo foi feito um primeiro ensaio de terapia gênica. Foi injetado o vetor com o detonador Cre-neocombinasa no tronco encefálico (uma das zonas mais afetadas pela enfermidade). Devido à ausência de frataxina, o camundongo manifesta os sintomas característicos da AF.

 

Este camundongo se submete a uma segunda injeção e se aplica ao mesmo tempo outro vetor, que neste caso leva o gene da frataxina. Para verificar se este camundongo é capaz de recuperar suas funções ele é submetido à prova do giro. A um grupo de camundongos se injeta um vetor sem recombinasa-Cre, a outro se injeta o vetor com recombinasa. Depois de quatro semanas, as diferenças entre ambos os grupos são evidentes, e depois de seis semanas essas diferenças se aguçam ainda mais.

 

Para a segunda parte deste estudo se elegem camundongos atáxicos de quatro semanas de idade. (Elegem-se camundongos de quatro semanas porque é um momento no qual a ataxia é visível, porém não estão muito afetados: supõe-se que assim seja mais fácil recuperar a função).

 

Este grupo de camundongos se divide em dois:

 

Aos camundongos do grupo A se injeta um vetor com um gene indiferente, uma enzima, a betagalactosidasa que colora os neurônios para poder localizá-los melhor.

 

Aos camundongos do grupo B se injeta um vetor com o gene da frataxina.

 

Em ambos os casos os camundongos mostravam certa melhora depois da injeção, porém esta melhora era muito mais evidente naqueles camundongos que tinham o gene da frataxina. A que se deve esta melhora dos camundongos com um gene aparentemente inativo? Não sabemos a resposta a esta pergunta, apesar de que este fenômeno não seja nada novo. Os pesquisadores acreditam que a injeção do vetor viral que às vezes pode ter efeitos tóxicos, possivelmente estimule a produção de fatores neurotróficos que ajudam a conseguir um efeito terapêutico transitório. Além de não resultar tóxico, o vetor é muito bem tolerado, e este fato é um bom sinal.

 

Em oito semanas, os camundongos que haviam recebido frataxina recuperaram todas as funções a tal ponto que se confundiram com os camundongos sadios. Produziu-se uma recuperação completa do fenótipo.

 

Conclusão: em um modelo muito simples, a terapia gênica é possível. Porém este modelo não é representativo da enfermidade humana, porque neste modelo de camundongo são muito poucos os neurônios afetados. É uma prova de conceito conseguida, porém ainda ficam questões:

 

- Conseguir uma boa distribuição do vetor em todos os neurônios afetados na enfermidade. A enfermidade afeta a medula espinhal, os gânglios da raiz dorsal, tronco do encéfalo e cerebelo fundamentalmente.

 

- Alcançar o resultado anterior com o menor número de injeções possível, porque toda injeção de um vetor é um procedimento invasivo.

 

- Regular adequadamente a expressão do gene da frataxina. A frataxina deve alcançar o nível adequado, nem demasiado pouca nem em excesso.

 

- Responder a todos os estímulos fisiológicos que regulam a frataxina e que os resultados sejam persistentes.

 

As construções que normalmente se empregam nos laboratórios não são genes de verdade, senão versões simplificadas chamadas cDNAs (DNA complementar).

 

Com estas construções não se pode conseguir uma expressão mais persistente. Para conseguir uma expressão mais persistente, é necessário trabalhar com um gene concreto da frataxina tal qual está no cromossoma, que é bastante grande, e formar uma espécie de micro cromossoma (uma pequena seqüência desse cromossoma que leva o gene da frataxina), encaixá-lo a um vetor viral e distribuí-lo às células. O Dr. Diaz Nido é de opinião que mediante esta estratégia se conseguirá uma expressão mais persistente do gene. De fato, os resultados ainda que preliminares, indicam que é assim. Portanto, a expressão destas construções gênicas chamadas "airbags" seria uma via para facilitar a persistência da expressão do gene.

 

- Demonstrar a eficácia da técnica em um modelo animal, um camundongo que realmente mimetize melhor a enfermidade. Isto tem sido difícil de encontrar, porém agora existe um modelo disponível, um único modelo no qual se introduziu a mesma mutação, desenvolvendo no camundongo uma enfermidade muito mais leve que no ser humano.

 

Na atualidade se está trabalhando para aperfeiçoar a técnica em todos estes aspectos. 

 

Para escutar em mp3 toda a apresentação acessar:

http://dowload.yousendit.com/19B64078324243AD

 

 



FONTE: Mensagem postada no grupo virtual Ataxianet, por Gian Piero Sommaruga

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