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                                                                                                                 Prof. Pierre Rustin

Il progetto di ricerca qui presentato è stato finanziato da BabelFAmily, AISA, Ataxia UK, FARA, ACHAF, APAHE e FASI .

A cura del Prof. Pierre Rustin 

(traduzione dall’inglese di Carlo M.G. Penzo, supervisionata dal dott. Filippo Fortuna)

Fonte - Bollettino AISA “Archimede”, marzo 2010, pagina 6 e 7

Un breve sommario del nostro passato contributo.

1) - Comprendere la FRDA

L'atassia di Friedreich (AF, FA o FRDA) deriva, nella quasi totalità dei casi [1], da una mancanza nella funzione della proteina fratassina dovuta ad una espansione GAA nel gene. Poco dopo l'identificazione del gene coinvolto in questa malattia, abbiamo riscontrato il difetto mitocondriale e dei gruppi ferro zolfo nei tessuti dei pazienti [2]. Abbiamo descritto estesamente il circolo vizioso che sembra sottostare alla malattia, associando intimamente alla perdita di complessi ferro-zolfo, uno stress ossidativo e un accumulo mitocondriale di ferro, che si sono tutti rivelati giocare un ruolo in un qualche stadio della malattia [3]. Infine abbiamo dimostrato l'insufficiente risposta di topi e cellule carenti di fratassina all'insulto ossidativo [4] .

2) - Trattamento della FRDA

Abbiamo quindi predetto sin dall'inizio del 1999 che antiossidanti diretti ai mitocondri avrebbero diminuito le conseguenze della carenza di fratassina. Abbiamo allora rapidamente iniziato la prima sperimentazione clinica utilizzando Idebenone, con qualche successo almeno nell'ipertrofia cardiaca notata frequentemente negli ammalati [5]. Poi, abbiamo proposto di utilizzare un approccio alternativo puntando direttamente alla funzione di perdita della fratassina, il primo attore della malattia. Con questo obiettivo abbiamo proposto di cercare di accrescere l'intera trascrizione delle proteine mitocondriali e dei componenti antiossidanti mitocondriali, sperimentando un ligando dei recettori PPAR . Abbiamo quindi selezionato il Pioglitazone, un medicinale in precedenza raccomandato per combattere il diabete, ma che aveva anche mostrato di avere un effetto protettivo in altre malattie neurologiche. Seguendo questa proposta è iniziata, nell'ottobre 2008, nel nostro ospedale (2 anni; 40 pazienti) una sperimentazione placebo-controllata in doppio-cieco.

Il nostro progetto: Identificare obiettivi sensibili addizionali nell'atassia di Friedreich

Sperimentando l'uso del Pioglitazone e dell'Idebenone abbiamo puntato al passo iniziale e finale dell'atassia di Friedreich. Ora abbiamo idea di puntare al passo(i) addizionale, intermedio e critico nelle conseguenze cellulari della carenza di fratassina. Finora è abbastanza difficile ordinare i differenti aspetti delle conseguenze cellulari della carenza di fratassina, cioè la perdita di complessi ferro-zolfo, lo stress ossidativo e l'accumulo di ferro mitocondriale. In rapporto con quest'ultimo c'è tuttavia un numero di evidenze, in entrambi, uomini e topi carenti di fratassina, che suggeriscono che l'accumulo di ferro sia un fenomeno piuttosto tardivo. In aggiunta abbiamo di recente fornito evidenza che chelare il ferro mitocondriale è una pericolosa arma a doppio taglio. Infatti una forte carenza di ferro mitocondriale finisce per bloccare le vie biosintetiche che richiedono il ferro (sintesi deicomplessi ferro-zolfo e dell’eme), provocando, da ultimo, la morte cellulare[6]. Come conseguenza, un uso prolungato di chelanti che agiscono depauperando il ferro mitocondriale può quindi rivelarsi abbastanza pericoloso per l'uomo. Piuttosto interessante, la perdita dei complessi ferro zolfo nei lieviti mutanti carenti di fratassina si è dimostrata ossigeno-dipendente, e i fibroblasti umani con bassa fratassina mostrano accresciuta sensibilità all'insulto ossidativo, anche con normale attività degli enzimi con complessi ferro-zolfo. Ciò suggerisce che l'ipersensibilità allo stress ossidativo sia un evento molto precoce, probabilmente antecedente alla perdita quantitativa dei gruppi ferro-zolfo. Noi ed altri attribuiamo questa ipersensibilità alla carente induzione della superossido dismutasi operata dallo stress ossidativo [4; 7]. Più recentemente abbiamo stabilito che questo si origina da una più generale insufficienza degli enzimi antiossidanti di fase II regolati dal fattore di trascrizione Nrf2 [8]. Mentre diversi gruppi dedicano una quantità di sforzi nel decifrare la funzione della fratassina nella biosintesi dei gruppi ferro-zolfo, noi abbiamo invece deciso, in questo nuovo progetto, di focalizzare la nostra attenzione sul meccanismo che può spiegare la perdita di funzione di Nrf2 associata alla carenza di fratassina. Questo sconosciuto meccanismo può gettare nuova luce sulla funzione della fratassina, aiutando ad identificare nuovi obiettivi ed aprire la via ad un nuovo modo di contrastare la malattia. Questo è un progetto su più anni che comporterà numerosi passi:

A. Decifrare la natura e la composizione del complesso proteico che porta l’Nrf2 actino ancoratonei mitocondri.
Il tentativo di compiere quest'analisi sarà fatta studiando varie linee cellulari umane (incluse cellule prelevate da tessuto neurale come SK-NAS) e colture cellulari umane primarie fibroblasti della pelle). Si noti che conosciamo già qualcuno dei componenti di questo complesso, fatto che ci aiuterà nell'identificazione di altri suoi membri.
1. Lo studio includerà l'analisi BN page del predetto complesso in condizioni non-denaturanti, utilizzando una serie disponibile di anticorpi che mirano a membri putativi del complesso. Il complesso sarà ottenuto con metodi di demolizione (pull-down) standard partendo dalla disgregazione cellulare usando condizioni moderate.
2. Se necessario, analisi ottenuta attraverso la spettrometria di massa del complesso putativo sia sfruttando la tandem affinity purification di proteine mirate di interesse (possibilmente migliorando il rapporto segnale rumore per mezzo della generazione di campioni puliti), sia mediante stable isotopic labelling di proteine per discriminare verosimilmente tra contaminanti e binding-partner genuini usando tecniche quantitative MS.
Il recente ingaggio nel nostro gruppo di uno specialista di queste tecniche le renderà prontamente disponibili per il progetto, se necessario, essendo la macchina già disponibile nel nostro ospedale.
3. Al termine di questa parte ci potrà essere l'esclusione di un sotto-gruppo di fratassina, poiché l'esistenza di un tale sotto-gruppo putativo è stato suggerito esista nel citosol cellulare.
4. Uno studio parallelo con una serie analoga di analisi sarà effettuato, in un secondo passo, su linee cellulari da pazienti. Abbiamo già stabilito che il fenotipo di queste cellule già indica una perdita di ancoraggio di Nrf2 alla rete actinica [8]

B. Mirare ai vari membri del complesso.
In questa parte del progetto vogliamo valutare/verificare il ruolo relativo dei vari componenti del complesso, in particolare il loro ruolo nella sensibilità allo stress ossidativo.
1. vogliamo fare uso del shRNA per reprimere i vari obiettivi (i componenti del complesso) in una linea cellulare (Flp-In T-Rex HEK-293) che ammette una unica e diretta inserzione in un locus definito la cui espressione può, in aggiunta, essere modulata mediante doxiciclina. Abbiamo precedentemente utilizzato con successo questo approccio per sovra esprimere una proteina allotopica della catena respiratoria [9]. Lo spegnimento dell'espressione del gene mirato verrà verificato mediante PRC quantitativa e/o Western blot.
2. le cellule ottenute saranno estensivamente descritte nel loro fenotipo, specialmente per il potenziale ostacolo della loro sensibilità allo stress ossidativo. Ciò ci darà l'opportunità di modulare le condizioni della coltura cellulare per determinare se non possiamo modulare le conseguenze, possibilmente includendo la stabilità dei complessi ferro-zolfo, in queste diverse cellule.

C. Il collegamento mancante..
In questa parte del progetto cercheremo di caratterizzare il collegamento esistente tra la fratassina localizzata nella matrice mitocondriale e il complesso contenente Nrf2 localizzato nel citosol. Diverse ipotesi possono essere tracciate per spiegare la disorganizzazione del complesso associato alla carenza di fratassina.
1. La prima ipotesi è la sovrapproduzione di specie ossidanti da parte dei mitocondri carenti di fratassina nei fibroblasti dei pazienti. Verificheremo questa ipotesi usando sonde fluorescenti redox sensibili, sapendo che il flusso di elettroni nella catena respiratoria di queste cellule in coltura carenti di fratassina non è affetta quantitativamente. Un intero insieme di cellule con un deficit negli enzimi della catena respiratoria già note per produrre tali specie ossidanti verrà usata come controllo positivo [10].
2. La seconda ipotesi richiederà l'esistenza di una proteina ferro-zolfo nel complesso legante Nfr2 che dovrà essere eccezionalmente sensibile (in rapporto ad altre ISP) al decremento del contenuto di fratassina mitocondriale. Una proteina come GRX2 che lega il gruppo ferro-zolfo per dimerizzare sarebbe stata un candidato perfetto, ma abbiamo stabilito in precedenza che essa non è affetta nei fibroblasti carenti di fratassina.

D. Ripristinare la normale risposta all'insulto ossidativo.
Abbiamo stabilito in precedenza che intrappolando perossido di idrongeno (uno dei composti ossidanti rilasciati dai mitocondri) si ripristina la normale funzione di Nrf2 nei fibroblasti dei pazienti. Tuttavia,
intrappolando perossido di idrogeno si può avere una serie di conseguenze non necessariamente ristrette-a o mediate-da un effetto sul complesso legante Nrf2, vogliamo:
1. analizzare/dimostrare la conseguenza di intrappolamento di perossido sulla stabilità del complesso.
2. identificare nuovi composti capaci di riallocare Nrf2 in cellule carenti di fratassina. Per questa parte dello studio utilizzeremo fibroblasti derivati da pazienti (immortalizzati in una linea cellulare a rapida crescita), usando la morte cellulare programmata da segnali ossidativi (tracciando la localizzazione di Nrf2 ripristinato) come criterio, e utilizzando la banca di composti (80 000) che abbiamo già testato in precedenti programmi di ricerca in cui siamo stati coinvolti.

Esiti finali che potremmo (vorremmo!) includere:
– una migliore comprensione dell'ostacolata risposta delle cellule carenti di fratassina allo stress ossidativo;
– caratterizzazione di un complesso proteico (e associata via di segnali intracellulari) che può giocare un considerevole ruolo tanto nell'atassia di Friedreich quanto in altre malattie neurodegenerative;
– identificazione di nuovo obiettivo(i) e nuovo composto( da sperimentare per contrastare l'atassia di Friedreich.

Bibliografia
1. Campuzano V, Montermini L, Molto MD, Pianese L, Cossee M, Cavalcanti F, Monros E, Rodius F, Duclos F, Monticelli A, Zara F, Canizares J, Koutnikova H, Bidichandani SI, Gellera C, Brice A, Trouillas P, De Michele G, Filla A, De Frutos R, Palau F, Patel PI, Di Donato S, Mandel JL, Cocozza S, Koenig M, Pandolfo M. Friedreich's ataxia: autosomal recessive disease caused by an intronic GAA triplet repeat expansion. Science 1996; 271; 1423-1427
2. Rotig A, de Lonlay P, Chretien D, Foury F, Koenig M, Sidi D, Munnich A, Rustin P. Aconitase and mitochondrial ironsulphur protein deficiency in Friedreich ataxia. Nat Genet 1997; 17; 215-217
3. von Kleist-Retzow JC, Chantrel-Groussard K, Rotig A, Munnich A, Rustin P. [Friedreich ataxia. 3 years after the
identification of the gene a glimmer of hope for therapy]. Dtsch Med Wochenschr 2000; 125; 293-295
4. Chantrel-Groussard K, Geromel V, Puccio H, Koenig M, Munnich A, Rotig A, Rustin P. Disabled early recruitment of antioxidant defenses in Friedreich's ataxia. Hum Mol Genet 2001; 10; 2061-2067
5. Rustin P, von Kleist-Retzow JC, Chantrel-Groussard K, Sidi D, Munnich A, Rotig A. Effect of idebenone on cardiomyopathy in Friedreich's ataxia: a preliminary study. Lancet 1999; 354; 477-479
6. Goncalves S, Paupe V, Dassa EP, Rustin P. Deferiprone targets aconitase: implication for Friedreich's ataxia treatment.BMC Neurol 2008; 8; 20
7. Jiralerspong S, Ge B, Hudson TJ, Pandolfo M. Manganese superoxide dismutase induction by iron is impaired in Friedreich ataxia cells. FEBS Lett 2001; 509; 101-105
8. Paupe V, Dassa EP, Goncalves S, Auchere F, Lonn M, Holmgren A, Rustin P. Impaired nuclear Nrf2 translocation undermines the oxidative stress response in Friedreich ataxia. PLoS ONE 2009; 4; e4253
9. Dassa EP, Dufour E, Goncalves S, Paupe V, Hakkaart G,Jacobs HT, Rustin P. Expressing the alternative oxidase complements cytochrome c oxidase deficiency in human cells. EMBO Mol Med 2009; 1; 30-36
10. Dassa EP, Paupe V, Goncalves S, Rustin P. The mtDNA NARP mutation activates the actin-Nrf2 signaling of antioxidant defenses. Biochem Biophys Res Commun 2008; 368; 620-624