Resumen por  Mari Luz González Casas

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Encuentro Ataxias 2008 

Organizado por el

Colectivo Ataxias en Movimiento, Madrid 

  

Madrid, 29 de abril de 2008 

Tercera  ponencia científica

Dr. Javier Díaz Nido. Centro de Biología Molecular Severo Ochoa. Universidad Autónoma de Madrid. 

“Terapia Génica en Ataxia de Friedreich. Modelos Celulares de Bulbo Olfatorio y su repercusión en los afectados.”

 Dr. Javier Díaz Nido

La ataxia de Friedreich es una enfermedad producida por deficiencia de frataxina en la mitocondria. Es fundamental estudiar qué le ocurre a las células carentes de frataxina para así comprender mejor las bases moleculares de la enfermedad ,  buscar biomarkers de la enfermedad  para ensayar todo tipo de estrategias terapéuticas, desde las más clásicas -farmacológicas- hasta las más recientes, como la terapia génica. En esto consisten los modelos celulares.

Se han hecho muchos estudios, pero la mayor parte de ellos se han llevado a cabo en modelos experimentales muy sencillos como levaduras, distintos invertebrados o un modelo muy accesible como los cultivos de fibroblastos procedentes de piel de pacientes con AF. Todos ellos han sido y son muy útiles para estudiar muchas funciones  de la frataxina.

La deficiencia de frataxina no afecta por igual a todas las células. La AF no es exclusivamente una enfermedad neurodegenerativa, puesto que todas las células del organismo del paciente de AF  tienen deficiencia de frataxina. Sin embargo, sólo algunas neuronas  fundamentalmente y algunas otras células muestran una alteración patológica. Por lo tanto, la deficiencia de frataxina no afecta por igual a todas las células. Por eso, este grupo de investigación se ha centrado en el estudio de la deficiencia de frataxina en las neuronas, abordando dos aspectos:

a)     Modelos celulares neuronales

b)     Estrategias de terapia génica dirigida al sistema nervioso.

a)     Modelos celulares neuronales

Dos tipos:

-  Células diferenciadas de neuroblastoma humano

-  Cultivos primarios de neuronas de ratón

Cada uno de estos modelos tiene sus ventajas y sus inconvenientes.

Líneas de neuroblastoma humano: Como modelos celulares neuronales se viene usando una estrategia a modo de truco, el llamado RNA de interferencia. Mediante esta estrategia se disminuye la expresión del gen de la frataxina, y esto se hace en cultivos de células. Para ello se han usado células diferenciadas de neuroblastoma humano. Son células obtenidas de tumores. Estas células se manipulan en el laboratorio, y en ellas se induce esa deficiencia de frataxina.

Ventajas:

-         Ofrecen una población celular muy homogénea, a diferencia de lo que sucede con los cultivos primarios. Esto está siendo muy útil para toda una serie de estudios transcriptómicos, bioquímicos etc.., que es mejor hacer en poblaciones celulares muy homogéneas.

-         Son células humanas.

Desventajas:

-          Son células que proceden de un tumor y que se diferencian en el laboratorio. Parece que sean neuronas maduras pero no se puede descartar que esa diferenciación no sea del todo normal.

Lo importante de todo esto es que se están obteniendo muchos datos: las neuronas, sólo una vez que alcanzan la madurez se hacen más susceptibles a esta deficiencia de frataxina; una célula puede proliferar, diferenciarse y sólo cuando alcanza realmente la madurez, el déficit de frataxina induce su degeneración. Se ha estudiado cómo se produce esta degeneración y de ello se ha  aprendido mucho.

Esto mismo se hizo en cultivos primarios de neuronas de ratones directamente extraídas del sistema nervioso central de los ratones.

Cultivos primarios de neuronas de ratón : las neuronas se extraen directamente del sistema nervioso central de los ratones. Son muy relevantes, podemos aislar neuronas de las zonas más afectadas por la enfermedad, neuronas de las zonas menos afectadas y estudiar así las consecuencias de la deficiencia de frataxina, identificar biomarcadores etc..

Inconvenientes:

-         Con los cultivos primarios, las poblaciones celulares son muy heterogéneas.

-         Son células de ratón; no son células de humanos y existen datos que nos hacen pensar que no es lo mismo el déficit de frataxina en la célula de ratón que en la célula humana. Por lo tanto, es importante disponer de modelos celulares humanos.

Debido a que ninguno  de estos dos modelos es ideal, se está  intentando desarrollar nuevos modelos, modelos neuronales que  permitan obtener neuronas humanas deficientes de frataxina. Para ello se siguen dos vías:

I) Partiendo de células madre embrionarias humanas, líneas establecidas en la actualidad, se pueden diferenciar las neuronas  e inducir el déficit de frataxina. Así tendríamos neuronas no derivadas de células tumorales en las que podríamos estudiar la deficiencia de frataxina.

II) Este segundo proyecto consiste en obtener progenitores neuronales de biopsias de pacientes con AF. Este es un proyecto que acaba de empezar, en colaboración con el Dr. José Luis Muñoz Blanco, neurólogo del Hospital Universitario de La Paz (Madrid). Objetivo: obtener progenitores neuronales de la mucosa olfativa.

La mucosa olfativa es uno de los pocos sitios, cuyo acceso es relativamente fácil y que contiene progenitores neuronales. En la mucosa olfativa están las células receptoras del olfato y junto a ellas hay una serie de progenitores que continuamente ocasionan nuevas neuronas olfativas receptoras, que van sustituyendo a las que se van perdiendo a lo largo de la vida. Así podemos aislar progenitores neuronales, cultivándolos para poder obtener neuronas a partir de ellos y finalmente poder tener neuronas de pacientes con ataxia de Friedreich.

Se ha comenzado obviamente con sujetos controles –donantes voluntarios-, personas que se someten a distintas operaciones de nariz, tabique nasal etc…y que dan su consentimiento para extraer una pequeña biopsia. De esta biopsia se obtienen células en  las que son capaces de crecer neuroesferas, ya que son células progenitoras neuronales. En la actualidad se procede a caracterizarlas. Una vez que se tenga una puesta a punto de esta técnica, el siguiente paso es obtener biopsias de pacientes con AF. A partir de ese momento, se utilizarán esas células, ya  que es un modelo celular más apropiado para profundizar en el conocimiento y buscar aproximaciones terapéuticas.

Llegado este punto, el Dr. Díaz  Nido hace un pequeño resumen de la situación en cuanto a terapias farmacológicas. De estas terapias farmacológicas, la única que ha llegado a una fase más avanzada es la Idebenona. Se ha demostrado que protege el músculo cardíaco y también se han reportado beneficios leves a nivel neurológico, aunque esta última afirmación no está exenta de polémica.

Los modelos celulares son herramientas muy importantes para poder probar fármacos de forma poco costosa, y experimentar en ratones aquéllos que resulten prometedores.

b)     Terapia génica

Conceptualmente es una terapia muy sencilla. Hay un gen defectuoso que no produce suficiente frataxina. La idea es colocar el gen correcto para elevar la cantidad de frataxina y así curar la enfermedad.

Para colocar el gen en las células es necesario que se empaquete en un vector, y que ese vector sea muy eficiente para que lleve el gen al mayor número de células posibles; sólo así el organismo tendrá un buen funcionamiento. Tiene que ser un vector capaz de llevar ese gen a todas las neuronas. Tienen que ser vectores herpes virales, que son los que cumplen las características requeridas.

El primer requisito es tener un modelo animal de ataxia de Friedreich, un ratón que padezca la enfermedad. Los ratones y los humanos tienen diferencias fisiológicas significativas y ha sido muy difícil obtener un modelo de ratón que reproduzca fielmente la AF. Algunos se parecen, pero no hay buenos modelos. Debido a que no hay buenos modelos, se  ha recurrido a un truco: obtener ratones modificados genéticamente. Al  gen de la frataxina se le colocan una especie de marcas, de tal manera que usando una enzima recombinasa-Cre, se consigue   eliminar de manera específica un fragmento de ADN situado entre dos secuencias denominadas loxP. En presencia de recombinasa- Cre, cualquier secuencia de ADN que se encuentre situada entre dos sitios loxP será eliminada del genoma. Así se elimina el gen de la frataxina. De esta forma se mimetiza en el ratón lo que sucede en la enfermedad.

Con este modelo se hizo un primer ensayo de terapia génica. Se inyectó el vector con el detonador Cre- recombinasa  en el tronco del encéfalo (una de las zonas más afectadas por la enfermedad). Debido a la ausencia de frataxina, el ratón manifiesta los síntomas característicos AF.

Este ratón se somete a una segunda inyección y se le aplica en el mismo punto otro vector, que en este caso lleva el gen de la frataxina. Para verificar si este ratón es capaz de recuperar sus funciones se le somete a prueba rotarod. A  un grupo de ratones se le inyecta un vector sin recombinasa -Cre, a otro se inyecta el vector con recombinasa-Cre. A las dos semanas se empieza a ver que los que reciben recombinasa-Cre tienen peor coordinación motora. A las 4 semanas, las diferencias entre ambos grupos son evidentes, y a las 6 semanas esas diferencias se agudizan aún más.

Para la siguiente parte de este estudio se eligen ratones atáxicos  de 4 semanas de edad. (Se eligen ratones de 4 semanas porque es un momento en el que la ataxia es visible pero todavía no están muy afectados- se supone que así es más fácil recuperar la función )

Este grupo de ratones se divide en dos.

A los ratones del grupo A se les inyecta un vector con un gen indiferente, una enzima, la betagalactosidasa que colorea las neuronas para poder localizarlas mejor.

A los ratones del grupo B se les inyecta un vector con el gen de la frataxina.

En ambos casos los ratones mostraban una cierta mejoría después de la inyección, pero esta mejoría era mucho más evidente en aquellos ratones que tenían el gen de la frataxina.

¿A qué se debe esta mejoría en ratones con un gen aparentemente inactivo? No se sabe la respuesta a esta pregunta, a pesar de que este fenómeno no es nada nuevo. Los investigadores creen que la inyección del vector viral, que a veces puede tener efectos tóxicos, posiblemente estimule la producción de factores neurotróficos que ayuden a conseguir un efecto terapéutico transitorio. A parte de no resultar tóxico, el vector es muy bien tolerado, y este hecho es una buena señal.

A las 8 semanas, los ratones que habían recibido frataxina han recuperado todas sus funciones hasta tal punto que se confunden con los ratones sanos. Se ha producido una recuperación completa del fenotipo.

Conclusión: en un modelo muy sencillo, la terapia génica es posible. Pero este modelo no es representativo de la enfermedad humana, porque en este modelo de ratón son muy pocas las neuronas afectadas. Es una prueba de concepto conseguida pero aún quedan retos:

-         Conseguir una buena distribución del vector en todas las neuronas afectadas en la enfermedad. La enfermedad afecta a la médula espinal, los ganglios de la raíz dorsal, tronco del encéfalo y cerebelo fundamentalmente..

-         Alcanzar el resultado anterior con el menor número de inyecciones posible, porque toda inyección de un vector es un procedimiento invasivo.

-         Regular adecuadamente la expresión del gen de la frataxina. La frataxina debe alcanzar el nivel adecuado, ni demasiado poca ni en exceso.

-         Responder a todos los estímulos  fisiológicos que  regulan la frataxina  y que los resultados sean persistentes.

Las construcciones  que normalmente se emplean  en los laboratorios no son genes de verdad, sino versiones simplificadas llamadas cDNAs (DNA complementario).

Con estas construcciones no se puede conseguir una expresión más persistente. Para conseguir una expresión más persistente, es necesario trabajar con el gen concreto de la frataxina tal cual está en el cromosoma, que es bastante grande, y formar una especie de microcromosoma (una pequeña secuencia de ese cromosoma que lleva el gen de la frataxina), empaquetarle un vector viral y distribuirlo a las células. El Dr. Díaz Nido es de la opinión que mediante esta estrategia se conseguirá una expresión más persistente del gen. De hecho, los resultados aunque preliminares, indican que es así. Desde luego, la expresión  de estas construcciones genómicas llamadas “airbags” sería una vía para facilitar la persistencia de la expresión del gen.

-         Demostrar la eficacia de la técnica en un modelo animal, un ratón que realmente mimetice mejor la enfermedad. Esto ha sido difícil de hallar, pero ahora existe un modelo disponible, un único modelo en el que se ha introducido la misma mutación, desarrollando en el ratón una enfermedad mucho más leve que en el ser humano.

En la actualidad se esta trabajando para optimizar la técnica en todos estos aspectos.

 

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Proyectos de investigación de la ataxia de Friedreich financiados por BabelFAmily

Cada vez que hagas un donativo o compres un ejemplar de nuestro proyecto literario "El legado de Marie Schlau", el 100% de lo recaudado será destinado a investigación biomédica sobre la ataxia de Friedreich.

En la actualidad la asociación BABELFAMILY financia dos proyectos muy prometedores:

1) Terapia de reemplazamiento de la proteina FRATAXINA: Más información aquí:

https://www.irbbarcelona.org/es/news/nuevo-frente-de-ataque-en-la-investigacion-de-la-ataxia-de-friedreich
Las asociaciones de familiares y pacientes Babel Family y la Asociación Granadina de la Ataxia de Friedreich (ASOGAF) impulsan con 80.000 euros de sus fondos de donaciones (50% cada una), un nuevo proyecto de investigación en el Instituto de Investigación Biomédica (IRB Barcelona) de 18 meses de duración. El objetivo concreto del proyecto es resolver una etapa necesaria hacia la meta de conseguir en el futuro una terapia de reemplazamiento de la proteína frataxina para los afectados de Ataxia de Friedreich, haciéndola llegar al cerebro, órgano en el que los bajos índices de esta proteína causan más daño.

El estudio lo dirige el científico Ernest Giralt en el laboratorio de Péptidos y Proteínas, con una larga experiencia y reconocimiento en química de péptidos y nuevos sistemas de administración de fármacos al cerebro, como las lanzaderas peptídicas, hábiles para cruzar la barrera que recubre y protege el cerebro cargadas con el medicamento. El laboratorio tiene en marcha otros dos proyectos de investigación en Ataxia de Friedrich desde que se iniciara la relación con las asociaciones de pacientes en 2013*.

2) Terapia génica para Ataxia de Friedreich: Más información aquí:

https://www.irbbarcelona.org/es/news/pacientes-y-cientificos-se-alian-para-combatir-la-ataxia-de-friedreich
Científicos del Centro de Biología Molecular Severo Ochoa de Madrid y del IRB Barcelona desarrollarán un proyecto de terapia génica consistente en introducir en las células del cuerpo una copia correcta del gen defectuoso que causa la enfermedad.

 

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